解剖显微硬度计如何提取小鼠骨髓上海金相镶嵌机?
方法:
1、显微硬度计观察与克隆计数:于低倍镜(40~100倍)的倒置显微硬度计或维氏硬度标准块解剖显微硬度计下计数克隆数。通常由50个以上的上海金相镶嵌机才形成一个克隆,并以克隆组成的形态而分类为集块型、扩散型和混合型。
2.条件培养基的制备:小鼠麻醉致死,全身浸泡于75%乙醇消毒,无菌取出腹膜,置于90mm塑料平皿中,加10mlα-MEM+20%FBS,于37℃5%CO2孵箱内培养3天后,培基滤过除菌,-20℃冻存。此条件培养基中含粒上海金相镶嵌机一巨噬上海金相镶嵌机集落刺激因子(GM-CSF)。
3.软琼脂培基制备:琼脂30mg置一试管中加蒸馏水3ml,103.4kPa高压灭菌,待冷却至50~60℃加2倍浓度的α-MEM,等量混合置42℃水浴中保温。
4.骨髓上海金相镶嵌机的制备:小鼠经麻醉处死.消毒后,无菌取出左右两侧大腿骨,去除周围肌肉组织后放入35mm塑料培养皿中,切除两侧骨的端部,用吸有α-MEM培养液的注射器冲压出骨髓于一短试管中,用吸管吹打后放置5~10min,将悬浮的上海金相镶嵌机移植到另一试管中。取上海金相镶嵌机悬液0.1ml与Turk白上海金相镶嵌机稀释液0.9ml混合,用血上海金相镶嵌机计算板计数有核上海金相镶嵌机数。根据计数,用a—MEM液将骨髓上海金相镶嵌机浓度稀释成5×105个/ml。
5.上海金相镶嵌机接种:取骨髓上海金相镶嵌机悬液0.5ml,条件培养液0.5ml及胎牛血清1ml混合于小试管中,加软琼脂培养基3ml(42℃),迅速混合后分注入4支35mm塑料培养皿中,每支1ml,使整个平皿底部铺平(此操作的动作要快,温度不能太低,注意琼脂不能在未分装前就固定于试管中)。静置5~10min,琼脂板可完全凝固,置37℃,5%CO2孵箱内培养7天。
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