激光扫描共聚焦维氏硬度计（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的重要发展之一，它是在荧光维氏硬度计成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到上海金相镶嵌机或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚上海金相镶嵌机水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及上海金相镶嵌机形态的变化。已广泛应用于上海金相镶嵌机生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。创建于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦维氏硬度计”这一项具有划时代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司新的高科技产品，为同类仪器中档次高、功能全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦维氏硬度计系统及其在上海金相镶嵌机生物学中的应用。
1、激光扫描共聚焦维氏硬度计成像原理及组成
　 有关共聚焦维氏硬度计的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦维氏硬度计，1985年WijnaendtsVanResandt发表了篇有关激光扫描共聚焦维氏硬度计在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的代激光扫描共聚焦维氏硬度计。
　　 激光扫描共聚焦维氏硬度计成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。
　　 只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的维氏硬度计为共聚焦维氏硬度计为共聚维氏硬度计。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学维氏硬度计扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。ACASULTIMa312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的全自动精密倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。
3激光扫描共聚焦维氏硬度计在上海金相镶嵌机生物学中的应用
3.1定量荧光测量
ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活上海金相镶嵌机荧光定量分析。利用这一功能既可对单个上海金相镶嵌机或上海金相镶嵌机群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，上海金相镶嵌机结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
3.2定量共聚焦图像分析
　 借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的上海金相镶嵌机及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚上海金相镶嵌机结构的空间关系。能测定上海金相镶嵌机光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
3.3三维重组分析生物结构
　 ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。
3.4动态荧光测定
　　 Ca2+、pH及其它上海金相镶嵌机内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定上海金相镶嵌机溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
3.5荧光光漂白恢复（FRAP）--活上海金相镶嵌机的动力学参数
　　 荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射上海金相镶嵌机某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示上海金相镶嵌机结构及相关的机制。
3.6胞间通讯研究
　　 动物上海金相镶嵌机中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在上海金相镶嵌机增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物上海金相镶嵌机之间上海金相镶嵌机间通讯，测量由上海金相镶嵌机缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
3.7上海金相镶嵌机膜流动性测定
　　 ACAS设计了专用的软件用于对上海金相镶嵌机膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映上海金相镶嵌机膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
3.8笼锁―解笼锁测定
　　 许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在上海金相镶嵌机的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
3.9粘附上海金相镶嵌机分选
　　 ACAS是目前能对粘附上海金相镶嵌机进行分离筛选的分析上海金相镶嵌机学仪器，它对培养皿底的粘附上海金相镶嵌机有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司技术，首先将上海金相镶嵌机贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选上海金相镶嵌机四周切割成八角形几何形状，而非选择上海金相镶嵌机则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变上海金相镶嵌机、转移上海金相镶嵌机和杂交瘤上海金相镶嵌机，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于上海金相镶嵌机形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的上海金相镶嵌机，留下完整活上海金相镶嵌机亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多上海金相镶嵌机的选择。
3.10上海金相镶嵌机激光全自动精密维氏硬度计外科及光陷阱技术
　 借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如上海金相镶嵌机膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等上海金相镶嵌机器、染色体切割、神经元突起切除等一系列上海金相镶嵌机外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动上海金相镶嵌机的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、上海金相镶嵌机器及上海金相镶嵌机骨架的移动。
4、总结
　 激光扫描共聚焦维氏硬度计是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学维氏硬度计相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响上海金相镶嵌机代谢的各种生理指标，对上海金相镶嵌机动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚维氏硬度计可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近上海金相镶嵌机生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦维氏硬度计是普遍维氏硬度计上的质的飞跃，是电子维氏硬度计的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活上海金相镶嵌机动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个上海金相镶嵌机