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荧光标定实验-可非常方便地观察荧光样品的表面形貌 永久性的染色过程被称为荧光标定。荧光标定过程是一个化学过程，通过化学键实现荧光团与非荧光分子如蛋白质、核酸或是合成聚合物之间的吸附。标定过程通常会采用一种荧光团反应衍生物，这种物质可以与目标分子的功能团发生反应。换句话说，通过这个过程便可以产生荧光分子。 为了实现样品在维氏硬度计下发出荧光，不论是采用荧光染色还是荧光标定的方法，染色以及标定过程本身不能改变样品或分子本身特有的性质。 荧光维氏硬度计 荧光维氏硬度计(fluorescence microscopy，FM)是利用荧光现象而不是光学反射或光学吸收的一种光学设备或光学维氏硬度计。一般来说，在单色紫外光灯照射下，样品被检测的区域部分必须能够发出荧光。 传统的荧光维氏硬度计示意图。其核心组成部分是水银弧光灯或氙弧光灯光源，感光滤光片(或是一组滤光镜)允许指定的单色紫外光线通过，分色镜(分光镜)使得激发光(短波长)被镜子反射但发射光(长波长)可以通过，样品台、发光滤波片(或是一组滤光镜)使得荧光通过并到达探测器，两组透镜(即聚光镜(激发光)和物镜(发射光))探测器用来探测图像。除此之外还要选择与激发光光谱相匹配的分色镜及与发光光谱相匹配的荧光团来标定样品。 如果样品的某个需要被检测的区域不能吸收紫外光继而发射荧光，该区域就必须采用荧光染料或是化学标定进行染色。 在光照条件下，荧光团会渐渐失去发出荧光的特性，这个过程被称为光漂白。多数的光漂白可以归因于自由基，特别是强光照更会加速光漂白的过程。其结果就是在短短时间内荧光团被“杀死”。因此必须采取一些特殊的措施来抑制光漂白。比如采用较为“强烈”的荧光团或是减小光照的能量和缩短光照的时间。 传统的荧光维氏硬度计可以非常方便地观察荧光样品的表面形貌，
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