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| 匀浆的差速离心技术详细介绍,-电子硬度计的运用 |
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匀浆的差速离心技术详细介绍,-电子硬度计的运用组织匀浆的差速离心法技术我们将对两种类型研究的结果加以探讨：首先讨论细胞分级分离的结果，然后讨论放射自显影的结论。在研究中，对受到隔离的细胞部分而言，基本和明确的要求是：必须弄清受到检测的部分恰好就是研究者认为正在接受检验的那些部分。 即是说，任何片段的特征都必须确定到这样一种程度，以至于保证它会包含着人们所预期的东西，并且，要确保这些成分没有受到其他物质的污染，而不至于混淆解释的意义。为达此目的，帕拉德和他的同事采用了两种操作方法。种方法是电子硬度计的运用：将各种细胞片段在电子硬度计下加以检测，然后再将它们拼配到一起，从而看上去类似于整体细胞切片的结构。第二种方法是化学分析：将细胞片段化验为我们已知的特定化学组成，或者被认为是包含在具体细胞结构之中的特定化学组成。 由于酶原粒具有明显的外表特征，所以相对易于在细胞片段的显微鉴定中得到确认。 同样，内质网膜上核糖体的出现，会为内质网的确认提供方便的途径(至少能鉴别出内质网的一部分)。作为对细胞进行匀浆化的结果，内质网断裂为微小的、类似囊泡的结构，这种结构物被称作微粒体。就好像在一一张完整的内质网内一样，核糖体附着在这些微粒体的外膜上。由于酶原粒和微粒体具有不同的沉淀特性，所以它们易于被分离开来。作为大和粘稠的细胞片段之一，在离心力是100 000克的情形下，酶原粒的沉淀量大约是1000克，而微粒体在同样的情况下只能沉淀很少，而且是在离心力的作用下才能从悬浊液中分离出来。从这种巨大的差异中可以得出结论：在这两种细胞片段之间，基本上不存在交叉污染。而且，这两种细胞片段的组成也由化学分析得到证实。酶原粒由于其高浓度状态的消化酶而得到确认，微粒体则是根据高层RNA(是蛋白质合成所必需的)的出现而得到确定，或者根据已知的、与这些结构相关联的细胞酶而得到确认。 其他细胞片段也以不同的沉淀特性在显微观察和化学分析中得到确定。某种包含高层次DNA的细胞核片段，在显微图像中可以看到它们包含着细胞核；在线粒体片段中，可以看到其特征性的线粒体和内膜，以及氧化代谢作用的酶(食物的氧化作用发生在线粒体之中)等。 由于细胞成分化学组成的知识首先大部分来自于分级分离的研究，所以，对这些成分的化学鉴定都具有循环的性质。 但是，尽管有这种约束，对某些细胞部分的确定，尤其是对酶原粒和微粒体的确认，都被认为是可靠的。 然而，在细胞成分的鉴定中还存在着两个难题。个难题是，在一种纯净或相对纯净的情形中，不可能收集到所有相关的细胞片段。当全部分离片段在类似的重力条件下沉淀时，会不同程度地与细胞的其他部分混杂在一起。其中，对于囊泡理论为重要的两种结构，高尔基体(由匀浆作用产生的其囊泡状片段)和微泡(位于内质网和高尔基体附近的小囊泡)的分离，就会成为令人棘手的问题。这两种物质不仅不能纯净地被分离开来，而且还与一团其他同样大小和同样密度的、类似于小囊泡的结构沉淀在一起(包括细胞膜片段)。从硬度计上观察，很难对这些物质进行相互区分，同时也不易对它们的性质进行彻底的化学分析。 因此，科学家们不能获得可以被明确地认定为是微泡还是高尔基体囊泡的沉淀物。此外，空的或正在填充的酶原粒(缩合空泡)也无法与充满了的或成熟了的酶原粒分离开来，也不能以差速沉淀方式形成不同的颗粒沉淀分层。因为它们全部都沉淀在一起，成为一个单独的片层。结果，放射波无法对于新生酶原粒的初出现进行示踪，即如同囊泡理论所预测的，经由颗粒填充阶段～直到酶原粒成熟阶段的示踪。 于是，不能获得所要求的细胞片段便使研究受到了严格的限制——关键性的证据无法获得。未知的和需要被探索的东西是，消化酶是怎样从核糖体移动到酶原粒的。但是，恰恰是那些据说包含在这一运动中的结构，不能作为纯净、可分离的片段被发现。蛋白质在小囊泡内运动着吗?它们会进入然后穿过高尔基体吗?那种初空的酶原粒被逐渐充满的过程能够被确定吗?这些核心问题都没有答案。 然而，对这种检验方法来说，存在着一些更加无法弥补而令人难堪的缺陷。 因为，一旦细胞经过匀浆化作用被打碎之后，那些被放射性物质标记了的蛋白质就会有一个在细胞不同成分之间重新分配的机会。在这种情况下，人们怎么能肯定某一特定片段中测量到的东西是在完整细胞中那种物质的天然所在呢?无论是整体地还是部分地，这些东西可能已经从某种其他来源中附加了什么。具破坏意味的是，人们如何能够确定这一转换的现象(更不要说其内容和特征)呢? 无疑，匀浆化作用为细胞成分的鉴定带来了关键的不确定性。 由此一来，各种细胞片段中物质所在的位置与其在完整细胞中的位置之间关系的问题，便不能有确定的解决办法。然而，如果放射性物质标记了的蛋白质从一个位置移动到另一位置需要加以确定的话，那么这种信息是必需的。这个问题我们在以前就遇到过。这正是缺乏从整体上进行说明的必然结果。在这种情况下，整体系统性的丧失体现在细胞匀浆化过程中各个部分之间的自然关系遭到破坏的那～后果。 即使这种实验的设计是为了确定完整细胞中蛋白质的运动，但在做出任何检测之前，又必须把细胞打碎，从而破坏了研究者所要探究的整体结构。对于所有细胞分级分离的研究来说，尽管这是一个重要而恼人的问题，但它并不意味着组织匀浆化在实验生物学中没有任何作用，也不意味着从这种检测中所衍生的任何信息都应当是被忽视的。将作为黑匣的细胞打开，对于细胞进行化学分析一直是极为关键的。没有这种“破坏性”的行为，我们对生命的化学性认识或许还仍然停留在细胞理论刚刚提出的初始阶段。但是，如果我们完全期望以这种方式来理解细胞的整体机制——具有空间解释的机制，那么我们就注定要么是一败涂地，要么是自欺欺人。通过匀浆化作用的化学行为，我们丧失了关键的信息。这些信息，永远无法依靠人类智慧的力量使其失而复得。 在囊泡理论的案例中，由匀浆作用导致的混淆不清被处理的方式，是极具启发性的，并且可以为相关研究领域中所做出的类似解释提供一个范例。更一般地说，它为细胞研究的常用方法提供了佳说明。令人遗憾的事实是，为了对结果进行解释，便不得不作出一些重要的推测，尤其是，研究者不得不对匀浆作用所产生的重新分配的特殊情形有所推测 这些推测是什么呢?首先而且乏味的推测，是假定放射性物质所标记的蛋白质能够从一个不明确的部分到另一部分的重新分布是必定已经发生了的，即是说，假定某些东西已经移动过。这种假定足够合理，甚至是显而易见的，因为匀浆作用导致了大范围的扰动。但是，这对于解释所发生的结果毫无帮助。必须假定某种更为确切的情形，特殊地说，何种成分已被重新分布，从哪里到哪里，对此必须作出清晰、量化的推测。只有这样做，我们才知道特定的细胞片段在数量上有多少被其他来源的成分污染了，亦即，这些来源包含的仅仅是污染物。 哪一片段被认为受到污染，哪一片段没有被污染，皆取决于它们与囊泡理论之间的关系。如果囊泡理论预测到放射性物质所标记的蛋白质将出现，那么就会假定它们处于这一所在，即那种未被别处来的物质所污染过的所在。如果它不在那里，那么就可以假定这里是一种人工造成的混合物。后一点，也是有意思的一点，如果物质没有出现在囊泡理论所预测的它应当出现的部分，或者仅仅少量出现，那么人们就假定这是匀浆作用的结果而使应当出现的物质丢失了。 当囊泡理论的有力证据开始出现时，上述假定便导致所有不符合这一理论的证据遭受不断的质疑。
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