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| 利用电子硬度计和荧光硬度计观察细胞中蛋白质 |
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利用电子硬度计和荧光硬度计观察细胞中蛋白质采用生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学和电子显微技术对蛋白质定向、转位和转运的机制已进行了广泛研究。本章将涉及用于蛋白质输出的研究技术。我们将这些技术分为四类：细胞内、遗传学、细胞外和细胞生物学技术。当检验一种蛋白质在完整细胞内的运动时，细胞内技术是必需的，并且常常使用遗传学方法来识别突变体。遗传学技术是细胞内技术的分支，它在蛋白质转运研究领域中起着重要的作用。遗传学技术已揭示了许多在蛋白质输出过程中转运复合体的蛋白质组分。细胞外技术也起到重要作用，它用于确定被纯化蛋白质的功能，目的在于通过实验重现蛋白质转运的过程。应用细胞生物学技术，已可利用电子硬度计和荧光硬度计观察一个蛋白质在细胞中的运动。 真核细胞细胞器和细胞膜的分离 采用生物化学方法确定蛋白质在亚细胞器上的准确定位需要破坏细胞形态，且需要将膜分离出来，因为真核细胞含有许多不同的膜。这些膜包括质膜、内质网膜、核膜、高尔基复合体膜、过氧化物酶体膜、溶酶体膜、线粒体膜，以及植物细胞中叶绿体膜和叶绿体中的类囊体膜。已有证据表明膜定位是蛋白质共定位到其目标膜上的过程。为了分离细胞器，首先要用尽可能温和的方法使细胞破碎。内质网膜，又称微体，通常用Potter-Elvehjem匀浆机将狗的胰腺匀浆，然后在低速离心下沉淀微体，再通过凝胶过滤柱进行过滤。用各细胞器的标志酶来鉴定其分离纯度。 细胞内研究·用药物和Sec突变体可揭示膜转位是否需要质子动力势能以及Sec蛋白的作用。·蛋白酶与膜的接触以及信号肽加工方面的研究为跨越细菌和内质网膜的蛋白质定位提供确定方法。·天冬氨酸连接的寡糖修饰可用于跟踪在分泌途径中的糖蛋白定位。·通过确定输出蛋白质是否与相应亚细胞组分一同被分离，可监测该蛋白质是否 定向到细胞器、细胞内膜结构或液态组分。
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